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遗传性肾脏疾病诊断治疗的快速发展，不仅带动了基因检测分析技术的进步，也推动了临床医学的多学科合作及疾病诊疗模式的转变。遗传性疾病的诊断已从表型到基因型，治疗也在从对症到靶向治疗。逐渐形成了表型引导，基因确诊和精准管理的诊治模式。Alport综合征（AS）是由编码IV型胶原3、4或5链的基因（COL4A3/4/5）突变引起的遗传性疾病。我们通过创新的“序贯式测序策略”，将中国AS队列的遗传诊断率提升至91.7%，并首次揭露了多种复杂变异和解析了中国AS患者特有的遗传特征。我们对555例经肾活检确诊的中国AS患者构建了一个逐层递进序贯式测序策略。首先通过全外显子测序（WES），锁定了87.6%患者的编码区变异和侧翼非编码区变异；在此基础上，针对WES阴性者，利用全基因组测序（WGS）搜寻深部非编码区（内含子）变异及拷贝数变异（CNV）；同时，对WGS阴性患者开展RNA测序，直接筛查异常剪接事件，再反向结合WGS数据定位致病性非编码区变异，以期提升非编码区变异的检测敏感性。最后，针对极其复杂的染色体结构重排，启用三代纳米孔长读长测序（NLRseq）技术，实现复杂结构变异的精准解析与破译。如此，我们在509例患者中发现了431个独特变异，总体检测率为91.7%。其中，42.2%的变异为全球首次发现。该项研究极大地拓展了AS基因变异谱，丰富了中国人群特有的基因变异信息。

致病基因检测，传统WES因其仅覆盖编码区及侧翼少量序列，难以检测深部内含子区等非编码区变异，而这类变异正是导致部分AS患者诊断不明的重要原因。我们创新性地采用WGS与RNA测序互补策略：首先对WES阴性患者进行WGS检测并预测异常剪接，随后通过minigene实验或RNA测序验证其致病性；同时，对预测阴性患者直接开展RNA测序，捕获真实发生的异常剪接事件，再反向比对WGS数据定位致病变异。通过这一策略，首次证实了位于内含子区域的基因变异在AS发病中的重要性。研究发现非编码区变异占到了COL4A3/4/5基因检出变异的11.4%~19.1%。通过WGS和RNA测序的联合应用，我们发现了多个位于内含子深部的变异，这些变异虽然不直接改变蛋白编码序列，却通过影响RNA剪接过程，导致了伪外显子插入或正常外显子跳跃，最终破坏IV型胶原蛋白的结构与功能。上述发现不仅证实了非编码区变异在AS发病中的重要贡献，还提示临床遗传诊断需突破“编码区优先”的传统思路。我们采用的“RNA测序驱动的WGS重分析”模式有效突破了计算机预测的局限性，实现了非编码区变异的高灵敏度解析，为解读遗传性疾病中非编码区变异的致病机制提供了借鉴。

我们发现，一些AS患者携带的遗传变异为大规模基因组结构重排，WES和WGS难以准确解析，而三代纳米孔长读长测序（NLR测序）则发挥出了其独特的优势。对经WES/WGS检测仍未确诊的13例患者进行NLR测序分析，成功在6例患者中鉴定出致病性结构变异，并首次发现两种AS新型结构变异类型，填补了AS结构变异研究的空白：读长测序技术方可实现对此类复杂结构变异的完整识别。该发现提示了结构变异在AS遗传病因中占据重要地位，更系统展示了长读长测序在解析复杂基因组重排方面的独特技术优势，为遗传性疾病中结构变异的精准检测提供了关键技术手段。

遗传性疾病具有明显的种族差异，我们重点探索了中国AS患者特有的遗传特征，并识别出两个在中国队列中相对高频的变异，这一发现也提示，建立针对中国人群的遗传病数据库至关重要。通过对临床表型与基因型的深度关联分析，发现在X连锁AS（XLAS）男性中，严重变异（如无义变异、截短变异、大片段删除）进展为终末期肾病（ESKD）的风险远高于以错义变异为代表的温和点突变；而COL4A5胶原区半合子变异则与严重的耳聋高度相关， COL4A3 杂合变异与肾囊肿的发生相关。此外，研究还发现了4.1%的患者同时携带两个胶原基因的变异，这类患者的表型往往比单基因变异更复杂，提示我们在临床遗传诊断筛查时必须同时关注多个基因变异。

序贯式基因测序和解析验证，不仅拓展了AS基因变异图谱，为疾病的基因诊断，指导治疗，预后判断奠定了基础，也为遗传性疾病的致病基因分析研究和临床基因诊断提供了借鉴。