遗传性骨病（GSD）是一组发病贯穿胎儿期至成年、在活产儿中发病率约1/5000（约占出生缺陷5%）的骨骼发育疾病。TRPV4基因作为导致遗传性骨病的41组基因中的第8组，其突变导致的一系列骨骼发育不良谱系疾病具有较强的表型异质性，以错义变异为主。在Clinvar中，意义不明变异在错义变异中的占比高达76.9%，在我们的自建队列中，收录的携带TRPV4意义不明变异的遗传性骨病患儿无法得到明确的分子诊断。因此，明确这些临床来源的意义不明的错义变异的致病性，对临床明确诊断以及再生育指导具有重要意义。

参考ACMG/AMP序列变异解读框架，以PS3/BS3功能学证据对自建队列中的VUS位点进行致病性再评级。根据TRPV4基因的通道功能特征，构建了包含亚细胞定位、Ca²⁺成像和电生理的分层检测体系：在HeLa细胞中异源表达各变异，定位正确者依次进行钙成像和膜片钳电流记录，以基础通道活性和激动剂诱导的峰值反应作为双参数功能读出。依据ClinGen SVI工作组建议，功能学结果须经量化校准方可转化为可用的PS3/BS3证据，为此采用OddsPath方法对分层检测数据进行校准。以来自ClinVar和gnomAD的8个致病/可能致病和8个良性/可能良性变异作为对照，量化“功能异常”与“致病性”之间的关联强度，从而确定PS3的证据强度。

功能学实验结果显示，致病/可能致病变异表现为基础通道活性升高和峰值反应降低的异常功能特征，而良性/可能良性变异则表现为功能正常，对16个参考变异进行OddsPath校准，得到OddsPath (P)=8.0和 OddsPath (B)=0.125的比值比，满足PS3_moderate和BS3_moderate的证据强度，表明该分层功能检测体系能够有效区分TRPV4致病与良性变异，PS3_moderate证据可用于VUS重分类。将该框架应用于自建队列，将3个变异（T89A、T193I、W785R）重分类为可能致病，诊断率提升50%；另外3个变异（E87K、R400Q、V693M）维持VUS状态。

该OddsPath校准功能实验方法提供了从功能数据到临床变异解读的稳健、可重复路径，显著提升诊断准确性，为受累家庭的遗传咨询和生育风险评估提供直接证据，并为钙离子通道病的致病性评估建立了可推广的范式。