目的：

骨缺损是临床常见问题，传统骨组织工程（BTE）依赖支架、种子细胞和生长因子，但现有支架的生物相容性和生长因子安全性限制其应用。本研究的核心目标在于开发一种新型3D打印PLGA/HA复合支架，通过融合肽修饰实现多功能化，增强支架的抗菌活性（降低感染风险）、成骨能力（促进骨再生）和血管生成性能（改善血液供应），以解决临界尺寸骨缺损无法自愈的难题。

方法：

1.融合肽设计与合成：设计三种融合肽：P1（E7-Pac-525）、P2（E7-FHRRIKA）、P3（E7-FHRRIKA-Pac-525），通过商业合成，纯度≥95%。使用VMD和I-TASSER软件预测其二级结构（均为α-螺旋）。

2.支架制备与表征：3D打印技术：以PLGA（乳酸:乙醇酸=75:25）和HA（45%质量比）为原料，通过挤出式3D打印机制备多孔支架，孔径和结构精确控制。

理化性质测试：包括扫描电镜（SEM）观察形貌、孔隙率（水置换法）、压缩强度（万能试验机）、降解率（PBS浸泡12周）。

肽加载优化：通过荧光标记肽确定最佳加载浓度（60 μg/mL），并测试肽释放曲线。

3.体外实验：

细胞实验：使用BMSCs（骨髓间充质干细胞）和Ea.hy926（血管内皮细胞），通过CCK-8检测增殖、Transwell检测迁移、活/死染色评估生物相容性。

抗菌活性：针对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli），进行菌落计数、抑制环实验、SEM观察细菌形态和CLSM活/死染色。

成骨和血管生成活性：通过实时PCR、Western blot、免疫荧光和染色（ALP、ARS）检测成骨因子（BMP2、RUNX2、ALP、OPN）和血管生成因子（VEGF、HIF-1α）的表达。

4.体内实验：

动物模型：在大鼠颅骨创建8mm临界尺寸缺损，植入不同组别支架（空白对照、PLGA/HA、P1-PLGA/HA、P2-PLGA/HA、P3-PLGA/HA），饲养3个月。

评估指标：Micro-CT分析骨体积/总体积（BV/TV）、组织学染色（H&E、Masson）观察新骨形成、免疫组化检测OCN和COL-I表达

结果：

1.支架理化性质：

3D打印支架呈现均匀多孔结构（孔隙率≈70%），压缩强度达3.8 MPa，满足骨支架力学要求；降解率在12周时约70%，与骨再生速率匹配；融合肽通过E7序列成功加载，P3组加载量最高，且肽的二级结构保持稳定（FTIR和XRD证实）。

2.体外生物活性：

生物相容性与迁移：所有支架组细胞增殖无毒性，但P3组显著促进BMSCs和Ea.hy926细胞迁移（Transwell实验显示迁移细胞数增加）。

抗菌能力：P1和P3组对S. aureus和E. coli均有强抑制作用（菌落减少>90%，抑制环明显），SEM和CLSM显示细菌膜损伤。

成骨与血管生成：P2和P3组显著上调成骨因子（BMP2、RUNX2表达提高2-3倍）和血管生成因子（VEGF、HIF-1α表达提高）；ALP和ARS染色显示P3组钙结节形成最多。

3.体内骨修复效果：Micro-CT和组织学显示，P3组新骨生成量最高（BV/TV比空白组提高约50%），缺损基本填充；H&E和Masson染色证实成熟骨组织形成，OCN和COL-I表达增强。

结论：

本研究成功制备出具有适宜羟基磷灰石（HA）含量和机械强度的3D打印PLGA/HA复合支架材料，并通过融合肽实现了该支架的多功能修饰。一系列抗菌与成骨融合肽通过羟基磷灰石结合序列靶向附着于支架表面。P3-PLGA/HA复合支架展现出良好的生物活性和安全性，可有效促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）和Ea.hy926细胞的迁移。该复合支架还能显著提升BMSCs中OPN、RUNX2、ALP和BMP2的表达水平，同时增强Ea.hy926细胞中VEGF和HIF-α的生成，同时抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，最终形成兼具骨诱导性和骨传导性的复合支架材料，在骨缺损部位展现出优异的成骨潜力。本研究为骨肿瘤工程（BTE）在骨缺损修复中的应用提供了更优选择方案。